Белоктун молекулярдык салмагын табуу ыкмалары химиялык, физикалык-химиялык жана физикалык. Кеңири таралган физика-химиялык ыкмалар гел хроматографиясы (колонка жана жука катмар) жана натрий додецил сульфатынын катышуусунда полиакриламиддик гель чөйрөсүндө электрофорез. Алар татаал жабдууларды жана көп сандагы сыноо материалын талап кылбайт.
Белоктун мүнөздөмөсү
Белоктар биологиялык келип чыккан жогорку молекулалуу полимерлер. Алар пептиддик байланыштар менен катар-катар байланышкан аминокислоталардан турат. Белоктордун көлөмү ошол эле аминокислоталардын санына жараша болот. Белоктордун элементардык курамынын орточо мааниси %:
- көмүртек - 50, 6-54, 5 диапазонунда;
- кычкылтек – 21,5-23,5 ичинде;
- азот - болжол менен 15,0-17,6;
- сутек - 6, 5-7, 3 диапазонунда;
- күкүрт – 0, 3-2, 5 ичинде;
- минералдык заттар - 0,5тен көп эмес.
Белоктар жөнөкөй, аминокислота калдыктарынан гана турган жана татаал, анын ичинде протездик топторго бөлүнөт. Белок эмес компоненттер углеводдор, липиддер, нуклеиндик кислоталар, витамин туундулары, металл иондору, гем жана башкалар болушу мүмкүн. Төрт белок структурасы бар.
Белоктордун аминокислота курамы кислота гидролизинин натыйжасында ион алмашуу хроматографиясынын жардамы менен бөлүнүп чыккан аминокислоталардын кийинчерээк бөлүнүшү менен табылат.
Аминокислоталардын ар биринин сандык көрсөткүчтөрү нингидрин ыкмасы менен аныкталат. Белок молекуласындагы аминокислоталардын ордун ачуу ферменттердин жардамы менен терминалдык аминокислоталардын ырааттуу бөлүнүшү жана аларды идентификациялоо аркылуу ишке ашырылат, бул белок молекуласынын түзүлүшүн аныктоого мүмкүндүк берет. Идентификациялоо алардын ар кандай физикалык-химиялык касиеттерине негизделет. Бул үчүн көбүнчө айрым аминокислоталар үчүн түс реакциялары жана хроматография колдонулат.
Мамыча гелинин хроматографиясы
Бул ыкма көптөгөн глобулярдык белоктордун молекулярдык массасынын логарифминин жана толтурулган гель (белгилүү бир тешикче өлчөмү) менен элюция көлөмүнүн сызыктуу көз карандылыгына негизделген. Ошентип, белоктун молекулалык салмагын аныктоо үчүн алдын ала калибрленген колонкадан анын элюциясынын көлөмүн гана табуу керек. Калибрлөө молекулалардын алдын ала белгиленген массалары бар белокторду колонка аркылуу өткөрүү жана алардын ар биринин элюция көлөмүн өлчөө жолу менен жүргүзүлөт. Эгерде Sephadex G-75 толтургуч катары колдонулса, анда молекулалык салмакты эсептөө эксперименталдык түрдө табылган теңдеме боюнча жүргүзүлөт:
lg M=5, 624 – 0, 752 (Ve / Vo), бул жерде M - каалаган молекуласалмагы; Ve – колонкадан чыгып жаткан текшерилүүчү зат менен эритменин көлөмү; Vo – эркин тилкенин көлөмү.
Талдоо үчүн көк декстран эритмеси (1%), NaCl эритмеси (0,1 моль/л), Sephadex G-75 (4 г), гемоглобиндин эритмеси (1%) керек болот.
Талдоо жүргүзүү
Даярдалган колонка Sephadex G-75 гели менен толтурулат жана NaCl эритмеси менен жуулат. Гель деңгээлинен жогору көтөрүлгөн NaCl эритмеси төгүлгөндөн кийин анын бетине 0,5 мл көк декстран эритмеси кылдаттык менен салынат. Андан кийин колонкадан чыккан суюктуктар градирленген цилиндрге чогултулат, алар эксперименттин аягына чейин сакталат. Алдын ала даярдалган пробиркаларга 20 тамчыдан агып чыга баштаган көк түстөгү эритме чогултулат. Алардын элюаты, биринчиден эң күчтүү түскө чейин, боёксуз фракциялар чогулган ошол эле градирленген цилиндрге куюлат. Эритменин өчүп бараткан түстөгү пробиркаларынын көлөмү эсепке алынбайт.
Бөлмөлгөн цилиндрде чогулган суюктуктун көлөмү колонканын бош көлөмү (Vo). Андан кийин мамычаны толтуруу кайталанат, бирок көк декстриндин ордуна гемоглобин эритмеси колдонулат. Максималдуу кызгылт түстөгү эритме чыкканга чейин өлчөөчү цилиндрдеги элюаттын көлөмү Ve маанисине барабар. Табылган Vo жана Ve маанилери тиешелүү теңдемеге алмаштырылып, белоктун массасы эсептелет. Белоктордун аминокислота курамы окшош ыкмалар менен табылат.
Жука катмарлуу гел-хроматография
Бул ыкманын принциби белоктун эритмесин Сефадекстин эң ичке катмары бар пластинкага жылдыруу учурунда алардын аралашмасы бир калыпта эмес бөлүштүрүлгөндүгүндө турат. Баштапкы баштапкы сызыктан ар бир белоктор басып өткөн аралыктан алардын молекулалык салмактарынын логарифмдерин табыңыз. Жука катмарлуу гель хроматографиясы аркылуу белоктун молекулалык салмагын аныктоо үчүн маркердик белоктор басып өткөн аралыктардын алардын молекулалык салмактарынын логарифмине көз карандылыгын чагылдырган калибрлөө графиги түзүлөт. Аны мурунтан эле колдонуп, изилденип жаткан белоктун жолунун узундугу жана анын молекуласынын массасы табылды.
Тажрыйбаны аткаруу үчүн сизге кыйшаюу бурчу өзгөрүлүүчү баскыч, ошондой эле хроматографиялык камера керек болот. Реагенттерден сизге Sephadex G-200 же G-150, натрий фосфат буфери, pH 7,4 (0,1 моль/л), бромофенол көк эритмеси (0,1%), CH 3эритмеси керек болот. COOH (5%), CH3COONa эритмеси (2%), белок маркер комплекти, хроматографиялык кагаз.
Эксперимент аткарылууда
Биринчиден, Sephadex гелин даярдоо керек, ал үчүн анын кургак массасы 4 г ашыкча натрий фосфат буферинде суспензияланып, андан кийин n.o. Капталдары 20x40 см болгон айнек табак жакшылап жуулат. Сефадексти ага колдонуудан мурун анын үстүндөгү буфер декантацияланат, андан кийин гель жакшылап аралаштырылат. Аны горизонталдуу жайгашкан табакка фарфор кашык менен сүйкөп, андан соң 1х22 см өлчөмүндөгү айнек таякчаны жылдырып бөлүштүрөт. Оготуу 1 мм калыңдыгы бүдүрчөлөр жана көбүкчөлөрү жок гель катмары тегиз таралганга чейин кайталанат. Даярдалган табак 15 мүнөт абада кургатылат, андан кийин хроматографиялык камерага салынат.
Фосфат буфери сырткы идиштерге куюлат, гель хроматографиялык кагаз менен буфер менен бириктирилет. Андан кийин камера жабылып, атайын стендге коюлат. Анын эңкейиш бурчу 7-10° болуп белгиленген. Каныккан үчүн камераны түнгө калтырыңыз.
Молекулярдык салмагы белгилүү болгон белоктордун эритмелери, ошондой эле изилденип жаткан үлгүлөр микропипетка менен колдонулат, ар бир порциянын көлөмү 0,02 мл болушу керек. Пластина горизонталдуу абалга кайтарылат жана белоктордун бөлүктөрү белгилүү чекиттерге колдонулат. Алардын ортосундагы аралык жана жогорку четине чейин 3 см болушу керек.. Андан кийин камера жабык жана 7-10 ° бурч менен жайгаштырылат. Гель хроматографиялык анализи 4 саат бою жүргүзүлөт.
Бөлүнгөн убакыттан кийин камера туурасынан жайгаштырылат, хроматографиялык кагаз алынат. Айнек табак горизонталдуу абалда стендге коюлат жана хроматографиялык кагазга «реплика» жасалат. Бул үчүн, ал прокатка прокатка пробирках жана колдонулат карата жука гель катмары, акырындык менен раскладывая. Бул учурда, кагаз ага жабышууга тийиш, бирок аны бүтүн сактоо үчүн кылдаттык менен жасоо керек. Кагаз табактын бетине 1 мүнөт калтырылат, андан кийин 90°С температурада 20 мүнөт кургатылат. жана атайын боёгуч табага салынган.
Натыйжалардын стенограммасы
Белок зоналарын аныктоо үчүн "реплика" бромофенол көк эритмесинде 3 мүнөткө салынат. Андан арыбоёкту уксус кислотасынын эритмеси менен эки жолу жууп, натрий ацетаты менен бекитуу керек. Андан кийин хроматографиялык кагаз муздак агын сууга жакшылап жуулат жана кургатылат. Андан кийин, алар ар бир белоктун башталгыч чекиттен тактын борборуна чейинки аралыкты өлчөй башташат.
Алынган маалыматтарга ылайык, калибрлөө графиги абсцисса огуна lа/lst (мында а индекси анализденгенге, ал эми st - стандарттык белокко) y огу боюнча - lgM. Сыноо үлгүсүнүн белок аймагынын башталышынан алыстыгын өлчөө менен протеин молекуласынын молекулярдык салмагы жана сунушталган структурасы графиктин жардамы менен аныкталат.
