Молекулярдык биологиялык изилдөө ыкмалары заманбап медицинада, соттук экспертизада жана биологияда чоң роль ойнойт. ДНК менен РНКны изилдөөдөгү жетишкендиктердин аркасында адам организмдин геномун изилдөөгө, оорунун козгогучту аныктоого, кислоталар аралашмасындагы керектүү нуклеин кислотасын таанууга ж.б.
Молекулярдык биологиялык изилдөө ыкмалары. Бул эмне?
Артка 70-80-жылдары илимпоздор биринчи жолу адамдын геномун чечмелей алышкан. Бул окуя гендик инженериянын жана молекулярдык биологиянын өнүгүшүнө түрткү берди. ДНК менен РНКнын касиеттерин изилдөө бул нуклеиндик кислоталарды азыр ооруну аныктоо, гендерди изилдөө үчүн колдонууга мүмкүн экендигине алып келди.
ДНК жана РНК алуу
Молекулярдык биологиялык диагностикалык методдор баштапкы материалдын болушун талап кылат: көбүнчө бул нуклеиндик кислоталар. Бул заттарды тирүү организмдердин клеткаларынан бөлүп алуунун бир нече жолу бар. Алардын ар бири өзүнүн артыкчылыктары жана кемчиликтери бар, жана бул зарылтаза нуклеиндик кислоталарды бөлүп алуу ыкмасын тандоодо эске алыңыз.
1. Мармур боюнча ДНКны алуу. Метод заттардын аралашмасын спирт менен тазалоодон турат, анын натыйжасында таза ДНК чөкөт. Бул ыкманын кемчилиги агрессивдүү заттарды колдонуу болуп саналат: фенол жана хлороформ.
2. Бум боюнча ДНКнын изоляциясы. Бул жерде колдонулган негизги зат - гуанидин тиоцианат (GuSCN). Ал атайын субстраттарда дезоксирибонуклеиндик кислотанын чөктүрүлүшүнө өбөлгө түзөт, андан кийин аны атайын буфердин жардамы менен чогултууга болот. Бирок, GuSCN PTC ингибитору болуп саналат жана анын чөккөн ДНКга түшкөн кичинекей бөлүгү да нуклеиндик кислоталар менен иштөөдө маанилүү роль ойногон полимераздык чынжыр реакциясынын жүрүшүнө таасир этиши мүмкүн.
3. Кошмалардын чөктүрүлүшү. Метод мурункулардан айырмаланып турат: дезоксирибонуклеин кислотасынын молекулалары эмес, аралашмалар чөктүрүлөт. Бул үчүн ион алмаштыргычтар колдонулат. Кемчилиги - бардык заттар туна албайт.
4. Массалык скрининг. Бул ыкма ДНК молекуласынын курамы жөнүндө так маалымат талап кылынбаган, бирок кээ бир статистикалык маалыматтарды алуу зарыл болгон учурларда колдонулат. Бул нуклеин кислотасынын структурасы жуучу каражаттар, атап айтканда щелочтор менен иштетилгенде бузулушу мүмкүн экендиги менен түшүндүрүлөт.
Изилдөө ыкмаларынын классификациясы
Бардык молекулярдык биологиялык изилдөө ыкмалары үч чоң топко бөлүнөт:
1. Күчөтүү (көп ферменттерди колдонуу менен). Бул жердеКөптөгөн диагностикалык методдордо чоң роль ойногон ПТР - полимераздык чынжыр реакциясын билдирет.
2. Күчөтүү эмес. Методдордун бул тобу нуклеин кислоталарынын аралашмаларынын иштешине түздөн-түз байланыштуу. Мисалдар: 3 блот, in situ гибриддештирүү ж.б.
3. Белгилүү бир зонд ДНКсы же РНКсы менен байланышуучу зонд молекуласынан сигналды таанууга негизделген методдор. Мисал гибриддик тартуу системасы (hc2).
Молекулярдык биологияны изилдөө ыкмаларында колдонула турган ферменттер
Көптөгөн молекулярдык диагностикалык методдор ферменттердин кеңири спектрин колдонууну камтыйт. Төмөндө эң көп колдонулгандар:
1. Чектөө ферменти - ДНК молекуласын керектүү бөлүктөргө "кесип салат".
2. ДНК полимераза - дезоксирибонуклеиндик кислотанын кош тизмектүү молекуласын синтездейт.
3. Тескери транскриптаза (ревертаза) - РНК үлгүсүндөгү ДНКны синтездөө үчүн колдонулат.
4. ДНК лигаза - нуклеотиддердин ортосундагы фосфодиэфир байланыштарынын түзүлүшү үчүн жооптуу.
5. Экзонуклеаза - дезоксирибонуклеиндик кислота молекуласынын терминалдык бөлүмдөрүнөн нуклеотиддерди жок кылат.
ПТР – ДНКны күчөтүүнүн негизги ыкмасы
Полимераздык чынжыр реакциясы (ПТР) заманбап молекулярдык биологияда активдүү колдонулат. Бул бир ДНК молекуласынан көп сандагы копияларды алууга боло турган ыкма (молекулалар күчөтүлөт).
ПЦРдин негизги функциялары:
- диагностикаоорулар;
- ДНК сегменттерин, гендерди клондоо.
Полимераздык чынжыр реакциясын жүргүзүү үчүн төмөнкү элементтер талап кылынат: баштапкы ДНК молекуласы, термостабилдүү ДНК полимеразасы (Taq же Pfu), дезоксирибонуклеотиддик фосфаттар (азоттуу негиздер булактары), праймерлер (1 ДНК молекуласына 2 праймер).) жана бардык реакциялар мүмкүн болгон буфердик системанын өзү.
ПТР үч этаптан турат: денатурация, праймерди күйдүрүү жана узартуу.
1. Денатурация. 94-95 градус Цельсий температурасында ДНКнын эки тилкесинин ортосундагы суутек байланыштары үзүлүп, натыйжада эки бир жиптүү молекулага ээ болобуз.
2. Праймерди күйдүрүү. 50-60 градус Цельсий температурасында праймерлер толуктоо түрү боюнча бир тилкелүү нуклеин кислотасынын молекулаларынын учтарына бекитилет.
3. Узартуу. 72 градус температурада дезоксирибонуклеиндик кислотанын кош саптуу молекулаларынын синтези ишке ашат.
ДНК секвенциясы
Молекулярдык биологиялык изилдөө ыкмалары көбүнчө дезоксирибонуклеиндик кислотанын молекуласындагы нуклеотиддердин ырааттуулугун билүүнү талап кылат. Генетикалык кодду аныктоо үчүн секвенирлөө жүргүзүлөт. Келечектин молекулярдык диагностикасы адамдын секвенирлөөсүнөн алынган билимге негизделет.
Төмөнкү секвенирлөө түрлөрү айырмаланат:
- Максам-Гилберт секвенциясы;
- Сэнжер секвенциясы;
- пироскевенирлөө;
- нанопурырааттуулук.
