Органикалык эмес жана органикалык чөйрөлөр тарабынан жарыктын жутулушу жана андан ары кайра эмиссиясы фосфоресценциянын же флуоресценциянын натыйжасы. Кубулуштардын ортосундагы айырма жарыктын жутулушу менен агымдын эмиссиясынын ортосундагы аралыктын узундугу. Флуоресценция менен бул процесстер дээрлик бир убакта, ал эми фосфоресценция менен бир аз кечигүү менен ишке ашат.
Тарыхый маалымат
1852-жылы британиялык окумуштуу Стокс флуоресценцияны биринчи жолу сүрөттөгөн. Ал жаңы терминди ультрафиолет нуруна кабылганда кызыл жарык чыгарган флюоршпаты менен жасаган эксперименттеринин натыйжасында ойлоп тапкан. Стокс кызыктуу көрүнүштү белгиледи. Ал флуоресценттик жарыктын толкун узундугу дүүлүктүрүүчү жарыкка караганда ар дайым узун экенин аныктаган.
19-кылымда гипотезаны ырастоо үчүн көптөгөн эксперименттер жүргүзүлгөн. Алар ар кандай үлгүлөр ультра кызгылт көк нурга дуушар болгондо флуоресценцияланарын көрсөтүштү. Материалдар, башкалардын арасында, кристаллдар, чайырлар, минералдар, хлорофилл,дарылык сырьёлор, органикалык эмес бирикмелер, витаминдер, майлар. Биологиялык анализ үчүн боёкторду түз колдонуу 1930-жылы гана башталган
Флуоресценттик микроскоптун сүрөттөлүшү
20-кылымдын биринчи жарымында изилдөөдө колдонулган кээ бир материалдар абдан өзгөчө болгон. Контрасттык ыкмалар менен жетүүгө мүмкүн болбогон көрсөткүчтөрдүн аркасында флуоресценттик микроскопия ыкмасы биомедициналык жана биологиялык изилдөөлөрдүн маанилүү куралы болуп калды. Алынган натыйжалардын материал таануу үчүн мааниси аз эмес.
Флуоресценттик микроскопиянын кандай пайдасы бар? Жаңы материалдардын жардамы менен өзгөчө спецификалык клеткаларды жана субмикроскопиялык компоненттерди бөлүп алуу мүмкүн болду. Флуоресценттик микроскоп айрым молекулаларды аныктоого мүмкүндүк берет. Ар түрдүү боёктор бир эле учурда бир нече элементтерди аныктоого мүмкүндүк берет. Жабдуулардын мейкиндикте ажыратылышы дифракция чеги менен чектелсе да, ал өз кезегинде үлгүнүн өзгөчө касиеттерине көз каранды, бул деңгээлден төмөн молекулаларды аныктоо да толук мүмкүн. Ар кандай үлгүлөр нурлануудан кийин автофлуоресценцияны көрсөтөт. Бул көрүнүш петрологияда, ботаникада, жарым өткөргүч өнөр жайында кеңири колдонулат.
Функциялар
Жаныбарлардын ткандарын же патогендик микроорганизмдерди изилдөө көбүнчө өтө алсыз же өтө күчтүү спецификалык эмес автофлуоресценция менен татаалдашат. Бирок, баалуулугуизилдөө белгилүү бир толкун узундугунда козголуп, керектүү интенсивдүү жарык агымын чыгарган компоненттердин материалына киргизүүнү алат. Фторохромдор структураларга (көзгө көрүнбөгөн же көрүнөө) өз алдынча жабышып калууга жөндөмдүү боектордун ролун аткарышат. Ошол эле учурда алар максаттарга жана кванттык түшүмдүүлүккө карата жогорку тандалмалыгы менен айырмаланат.
Флуоресценттик микроскопия табигый жана синтетикалык боёктордун пайда болушу менен кеңири колдонула баштады. Алардын атайын эмиссиясынын жана дүүлүгүүнүн интенсивдүүлүгүнүн профилдери бар жана белгилүү биологиялык максаттарга багытталган.
Айрым молекулаларды идентификациялоо
Көп учурда идеалдуу шарттарда бир эле элементтин жарыгын каттай аласыз. Бул үчүн, башка нерселер менен катар, жетишерлик төмөн детектордук ызы-чуу жана оптикалык фон камсыз кылуу зарыл. Флуоресцеин молекуласы жок кылынганга чейин 300 000 фотонду чыгара алат. 20% чогултуу ылдамдыгы жана процесстин эффективдүүлүгү менен аларды 60 миңге жакын
өлчөмүндө каттаса болот.
Көчкү фотодиоддоруна же электрондордун көбөйүшүнө негизделген флуоресценттик микроскоп изилдөөчүлөргө айрым молекулалардын кыймыл-аракетин секундага, ал эми кээ бир учурларда бир нече мүнөткө байкоого мүмкүндүк берди.
Кыйынчылыктар
Негизги көйгөй – оптикалык фондогу ызы-чууну басуу. Фильтрлерди жана линзаларды курууда колдонулган көптөгөн материалдар бир аз автофлуоресценцияны көрсөткөндүктөн, окумуштуулардын аракеттери алгачкы этаптатөмөн флуоресценция менен компоненттер. Бирок, кийинки эксперименттер жаңы тыянактарды алып келди. Атап айтканда, жалпы ички чагылууга негизделген флуоресценттик микроскопия аз фонго жана жогорку дүүлүктүрүүчү жарык чыгарууга жетишээри аныкталган.
Механизм
Толук ички чагылууга негизделген флуоресценттик микроскопиянын принциптери тез чириген же таралбаган толкунду колдонуу болуп саналат. Ал ар кандай сынуу көрсөткүчтөрү бар чөйрөлөрдүн ортосундагы интерфейсте пайда болот. Бул учурда жарык шооласы призмадан өтөт. Анын сынуу көрсөткүчү жогору.
Призма суудагы эритмеге же төмөн параметрлүү айнекке жанаша жайгашкан. Эгерде жарык шооласы ага критикалык бурчтан чоңураак бурч менен багытталса, нур интерфейстен толугу менен чагылдырылат. Бул көрүнүш, өз кезегинде, таралбаган толкунду пайда кылат. Башкача айтканда, 200 нанометрден азыраак аралыкта сынуу көрсөткүчү төмөн чөйрөгө кирген электромагниттик талаа пайда болот.
Жайылбаган толкунда жарыктын интенсивдүүлүгү флюорофорлорду дүүлүктүрүү үчүн жетиштүү болот. Бирок, анын өзгөчө тайыз тереңдигинен улам, анын көлөмү өтө аз болот. Натыйжада төмөнкү деңгээлдеги фон.
Модификация
Толук ички чагылдырууга негизделген флуоресценттик микроскопияны эпи-жарыктандыруу менен ишке ашырууга болот. Бул үчүн сандык диафрагмасы көбөйгөн линзалар (жок дегенде 1,4, бирок ал 1,45-1,6га жеткени жакшы), ошондой эле аппараттын жарым-жартылай жарыктанган талаасы талап кылынат. Акыркы бир кичинекей так менен жетишилет. Көбүрөөк бирдейлик үчүн ичке шакек колдонулат, ал аркылуу агымдын бир бөлүгү жабылат. Толук чагылуу пайда болгон критикалык бурчту алуу үчүн линзалардагы жана микроскоптун капкагындагы айнектеги чөмүлүүчү чөйрөнүн сынуусунун жогорку деңгээли керек.
