ДНКны гибриддештирүүнүн негизинде эмне жатат? Кош тилкелүү ДНК ырааттуулугу физиологиялык шарттарда жалпысынан туруктуу болсо да, лабораторияда бул шарттарды өзгөртүү (адатта айлана-чөйрөнүн температурасын жогорулатуу жолу менен) молекулалардын айрым тилкелерге бөлүнүшүнө алып келет. Акыркылар бири-бирин толуктап турат, бирок алардын чөйрөсүндө болгон башка ырааттуулуктарды да толуктай алат. Айлана-чөйрөнүн температурасын төмөндөтүү бир катарлуу молекулалардын бири-бири менен эринишине же "гибриддешине" мүмкүндүк берет. Бул ДНКны гибриддештирүү ыкмасы.
Молекулярдык биологиянын көз карашынан түшүнүк
ДНКнын репликациясына жана ДНКнын РНКга транскрипциясына катышкан илимпоздор нуклеотиддердин кроссоверлерине жана молекулярдык биологиянын ыкмаларына таянышат. Буга Түштүк жана Түндүк блиттер, полимераздык чынжыр реакциясы (ПЦР) жана ДНК-РНК гибриддештирүү жана секвенирлөө ыкмалары кирет.
Колдонмо
Гибриддештирүү нуклеотиддин негизги касиетиырааттуулугу жана молекулярдык биологиянын көптөгөн методдорунда колдонулат. Эки түрдүн жалпы генетикалык байланышын алардын ДНКсынын сегменттерин гибриддештирүү (ДНК-ДНК гибриддештирүү) аркылуу аныктоого болот. Бир-бирине жакын организмдердин ырааттуулугу окшош болгондуктан, алыскы организмдерге салыштырмалуу мындай ДНК гибриддерин эритүү үчүн жогорку температура талап кылынат. ДНК үлгүсүнүн келип чыгышын, анын ичинде полимераздык чынжыр реакциясын (ПЦР) аныктоо үчүн ар кандай ыкмалар гибриддештирүү колдонулат. Башка ыкмада, кыска ДНК тизмектери экспрессияланган гендерди аныктоо үчүн клеткалык мРНКга гибридделет. Фармацевтикалык компаниялар антисенстик РНКны керексиз mRNA менен байланыштырып, рибосоманын мРНКны белокко айландыруусуна жол бербөө үчүн колдонууну изилдеп жатышат.
ДНК-ДНК гибриддештирүү жалпысынан ДНК ырааттуулугу бассейндеринин ортосундагы генетикалык окшоштуктун даражасын өлчөй турган молекулярдык биология техникасын билдирет. Ал көбүнчө эки организмдин ортосундагы генетикалык аралыкты аныктоо үчүн колдонулат. Ал филогенияда жана таксономияда кеңири колдонулган.
Методология
Бир организмдин ДНКсы этикеткаланган, андан кийин аны менен салыштырууга мүмкүн болгон белгиси жок ДНК менен аралаштырылды. Аралашма ДНК тилкелеринин диссоциацияланышына мүмкүндүк берүү үчүн инкубацияланат, андан кийин регенерацияланган гибриддик кош тилкелүү ДНКны түзүү үчүн муздайт. Окшоштуктун жогорку даражасы бар гибриддештирилген тизмектер тыгызыраак байланышат жана аларды бөлүү үчүн көбүрөөк энергия талап кылынат: б.а., алар жогорку температурада ысытылганда бөлүнүшөт.окшош эмес ырааттууларга караганда температура, бул процесс "ДНК эрүү" деп аталат.
ДНК эрүү
Гибриддештирилген ДНКнын эрүү профилин баалоодо, кош тилкелүү ДНК "мамыча" деп аталган нерсеге байланып, натыйжада аралашма ысытылат. Ар бир кадамда колонка жуулат жана эриген ДНК тизмектери бир тилкеге айланып, колонканы жуушат. Белгиленген ДНК мамычадан чыккан температуралар ырааттуулуктун ортосундагы окшоштуктун көлөмүн чагылдырат (жана өзүн-өзү бүктөлүүчү үлгү башкаруу катары кызмат кылат). Бул натыйжалар организмдердин генетикалык окшоштук даражасын аныктоо үчүн бириктирилген. Заманбап микробиология боюнча, буларды түшүнбөй туруп, ДНКны гибриддештирүү мүмкүн эмес.
Рибонуклеиндик кислотанын (же дезоксирибонуклеиндик) кислоталардын бир нече түрлөрүн ушундай жол менен салыштырганда, окшоштук маанилери түрлөрдү филогенетикалык даракка жайгаштырууга мүмкүндүк берет. Ошондуктан, бул молекулярдык систематиканы жүргүзүү үчүн мүмкүн болгон ыкмалардын бири болуп саналат. Чарльз Сибли жана Джон Ахлквист, бул техниканын пионерлери, канаттуулардын (Сибли-Ахлквист таксономиясы) жана приматтардын филогенетикалык байланыштарын изилдөө үчүн ДНК-ДНК гибриддештирүү ыкмасын колдонушкан.
Биология үчүн мааниси
ДНК-ДНК гибриддештирүү бактериялык түрлөрдү айырмалоонун алтын стандарты болуп саналат, окшоштук мааниси 70%дан ашат, бул салыштырылган штаммдардын ар кандай түрлөргө таандык экенин көрсөтөт. 2014-жылы бактериялык түрчөлөрдү бөлүү үчүн 79% окшоштук босогосу сунушталган.
Сынчылар бул ыкма жакын түрлөрдү салыштыруу үчүн так эмес деп ырасташат, анткени организмдердин ортосундагы ортоологиялык тизмектердин ортосундагы айырмачылыктарды өлчөө аракети организмдин геномундагы паралогдук окшоштордун гибриддештирүүсүнө жол бербейт. Учурда генетикалык аралыкты аныктоо үчүн ДНК ырааттуулугу жана эсептөө ырааттуулугун салыштыруу кеңири колдонулат, бирок бул ыкма дагы эле микробиологияда бактерияларды аныктоого жардам берүү үчүн колдонулат.
Учурдагы жол - толук же жарым-жартылай секвенирленген геномдорду колдонуу менен силикондо ДНК-ДНК гибриддештирүү жүргүзүү. DSMZ тарабынан иштелип чыккан GGDC DDH сыяктуу баалуулуктарды эсептөө үчүн эң так белгилүү курал болуп саналат. Алгоритмдик башка өркүндөтүүлөр менен катар ал паралогдук ырааттуулуктар менен маселени эки геномдук ырааттуулуктун ортосундагы дал келүүлөрдөн кылдат чыпкалоо менен чечет.
БАЛЫК ыкмасы
Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) – көбүнчө белгилүү бир хромосомадагы ДНКны аныктоо жана ырааттуулугун аныктоо үчүн колдонулган лабораториялык ыкма.
1969-жылы Джозеф Галл жана Мэри Лу Парду рибосомалык ДНК ырааттуулугунун радиоактивдүү көчүрмөлөрү баканын жумурткасынын ядросундагы комплементарлык ДНК тизмектерин аныктоо үчүн колдонулушу мүмкүн экенин көрсөткөн эмгекти басып чыгарышкан. Бул оригиналдуу байкоолордон бери көптөгөн тактоолор ар тараптуулукту жана көбөйдүпроцедуранын сезгичтиги ушунчалык даражада, ошондуктан in situ гибриддештирүү («жеринде», латынча) азыр цитогенетиканын маанилүү куралы болуп эсептелет. (In situ термини азыр патологиялык процесске эпителий кыртышы гана катышкан рактын өсүшүнүн баштапкы стадиясына карата да колдонулат.)
Флуоресценттик гибриддештирүү ырааттуулугу
РНК зонддору ткандардагы жана клеткалардагы lncRNA жана miRNA mRNAны визуализациялоо үчүн ар кандай ген же ген ичиндеги каалаган ырааттуулук үчүн иштелип чыгышы мүмкүн. FISH клетканын көбөйүү циклин, атап айтканда, ар кандай хромосомалык аномалиялар үчүн ядролук интерфазаны изилдөө аркылуу колдонулат. FISH архивдик иштердин чоң сериясын анализдөөгө мүмкүндүк берет, окшош хромосомаларды тарта турган жасалма хромосомалык базасы бар зонд түзүү аркылуу аныкталган хромосоманы аныктоо алда канча оңой.
Ядролук аномалия табылганда ар бир зонд үчүн гибриддештирүү сигналдары: ар бир mRNA жана lncRNA аныктоочу зонд 20 жуп олигонуклеотиддерден турат, ар бир жуп 40-50 bp мейкиндигин камтыйт. б. Пробдор мРНКны аныктоо үчүн патенттик химияны колдонушат.
ДНК зонддору менен гибриддештирүү
Зонддор көбүнчө ДНК фрагменттеринен жасалат, алар изоляцияланган, тазаланган жана адамдын геномун долбоорлоодо колдонуу үчүн күчөтүлгөн. Адамдын геномунун көлөмү түздөн-түз тизилиши мүмкүн болгон узундукка салыштырмалуу ушунчалык чоң болгондуктан, аны экиге бөлүү керек.фрагменттери. Акыр-аягы, бул фрагменттер ар бир фрагменттин көчүрмөсүн ырааттуулукка тиешелүү эндонуклеазаларды колдонуу менен андан да кичине бирдиктерге сиңирүү жолу менен, чоң фрагменттердин бири-бири менен кай жерде бири-бирине дал келгенин аныктоо үчүн бул маалыматтын жардамы менен өлчөмдү алып салуу хроматографиясынын жардамы менен ар бир кичинекей фрагменттин өлчөмүн өлчөө жолу менен буйрутмаланган..
Элементтерди жеке ДНК ырааттуулугу менен сактап калуу үчүн, үзүндүлөр дайыма кайталануучу бактерия популяцияларынын системасына кошулган. Бактериялардын клоналдык популяциялары, ар бир популяция бир жасалма хромосоманы сактап, дүйнө жүзү боюнча ар кандай лабораторияларда сакталат. Жасалма хромосомалар (BACs) китепканасы бар каалаган лабораторияда өстүрүлүп, алынышы жана маркировкаланышы мүмкүн. Геномдук китепканалар көбүнчө алар иштелип чыккан мекемелердин аты менен аталган. Мисал катары Буффалодогу (Нью-Йорк, АКШ) Розуэлл Рак Институтунун атынан аталган RPCI-11 китепканасын алсак болот. Бул фрагменттер 100 миңге жакын базалык жуптарды түзөт жана көпчүлүк БАЛЫК зонддорунун негизин түзөт.
